Information zur Erstellung transgener Labortiere und Empfehlung zur tierschutzrechtlichen Wertung

Transgene Tiere sind in der biomedizinischen Forschung von großer Bedeutung, so daß eine internationale Harmonisierung der rechtlichen Handhabung im Sinne der internationalen Chancengleichheit dringend erforderlich ist.

Der Ausschuß für Genetik und Labortierzucht der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS) legt zur Problematik der Erstellung transgener Labortiere / transgener Tiere einen Regelungsvorschlag vor. Die Regelung sollte bei der einschlägigen Gesetzgebung und Gesetzesdurchführung (Ausführungsbestimmungen) berücksichtigt werden.

Diese Empfehlung richtet sich gleichermaßen an Genehmigungs- und Aufsichtsbehörden, Tierschutzbeauftragte und Antragsteller und beinhaltet:

1. Definition transgener Tiere
2. Grundlegende Information zu den Techniken des Gentransfers
3. Tierschutzrechtliche Einordnung der einzelnen Schritte des Gentransfers nach dem geltenden Recht in Deutschland
4. Vorschlag zur internationalen Rechtsharmonisierung
5. Literatur

2.1 Mikroinjektion
Das klassische Gentransferverfahren seit Beginn der 80er Jahre ist die DNA-Mikroinjektion in einen der Vorkerne befruchteter Eizellen. Diese Methode ist bei verschiedenen Labor- und Nutztierspezies etabliert. Das Verfahren ermöglicht einen additiven Transfer definierter DNA-Abschnitte mit zufälliger Integration bezüglich Integrationsort und Zahl integrierter Kopien.

Die Expression integrierter Sequenzen kann durch Auswahl geeigneter regulatorischer Elemente im Hinblick auf Höhe, Gewebespezifität und zeitlichen Verlauf in gewissen Grenzen gesteuert werden. Durch die zufällige Integration können endogene DNA-Sequenzen unterbrochen werden (Insertionsmutagenese). Andererseits kann die Expression von Transgenen durch benachbarte endogene Sequenzen beeinflußt werden (Positionseffekt).

2.2 Transfizierte Zellinien
Ein neueres (1987), bislang nur bei der Maus etabliertes Verfahren, das embryonale Stammzellen als Vektoren verwendet, ermöglicht definierte Genlocus-spezifische Veränderung im Erbgut. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) werden aus frühen Embryonalstadien etabliert und können unter geeigneten Bedingungen permanent als pluripotente Zellinien in vitro kultiviert werden. Damit kann man diese Zellen in vitro mit bestimmten Genkonstrukten transfizieren und auf den Einbau an einer bestimmten Stelle im Genom selektieren. Gezielt mutierte ES-Zellen werden in ein frühes Embryonalstadium überführt (durch Aggregation mit Morulae oder Injektion in Blastozysten), wo sie in alle Gewebe einschließlich der Keimbahn differenzieren und zur Entstehung einer Chimäre führen können. In Abhängigkeit vom Ausmaß der Keimbahnbesiedelung durch die ES-Zellen erhält man bei der Zucht mit solchen Mäusen in der nächsten Generation einen mehr oder weniger großen Anteil von Nachkommen, welche die gezielte Mutation von Beginn der Embryonalentwicklung an in allen Zellen tragen. Für auf diese Weise erzeugte Defektmutanten hat sich der Begriff "Knockout Maus" * eingebürgert.

2.3 Kombiniertes Verfahren
Eine Kombination der DNA-Mikroinjektion und der Verwendung gezielt transfizierter Zellinien erlaubt eine weitere Spezifizierung des Eingriffs im Genom mit Wirkung auf ein bestimmtes Zielgewebe und / oder einen bestimmten Entwicklungsabschnitt eines Organismus. Man verwendet dazu sog. Rekombinase-Systeme, die aus einem Rekombinaseenzym und kurzen Zielsequenzen für dieses Rekombinaseenzym bestehen.

Das bekannteste Beispiel ist die cre Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1 mit ihrem zugehörigen Zielsequenzen loxP. Liegen diese loxP Sequenzen in gleichsinniger Orientierung auf einem DNA Molekül, so wird der zwischen den loxP Sequenzen liegende DNA-Abschnitt unter Einwirkung der cre Rekombinase herausgeschnitten.

Für die genort-, organ- und zeitspezifische in vivo-Mutagenese in Mäusen erstellt man zwei Linien transgener Mäuse:

• In einer Linie werden über homologe Rekombination in ES-Zellen (vgl. Punkt 2.2) loxP sites im Bereich des Zielgens definiert positioniert. Wichtig ist dabei, daß die loxP Sequenzen per se die Funktion des Zielgens nicht stören, während nach der Deletion des zwischen den loxP Sequenzen liegenden DNA-Abschnitts das Gen aktiviert sein muß.
• Die zweite Linie, welche die cre Rekombinase nur im gewünschten Gewebe und / oder Entwicklungsabschnitt exprimiert, wird durch DNA-Mikroinjektion erstellt (vgl. 2.1).

Kombiniert man diese beiden Linien, so erhält man Kreuzungsmäuse, in denen ein bestimmtes Gen im Zielgewebe erst zu einem definierten Zeitpunkt / Entwicklungsabschnitt inaktiviert wird.

2.4 Retrovirale Vektoren
Eine weitere Möglichkeit für den Gentransfer ist die Verwendung retroviraler Vektoren. Retroviren besitzen zwei Kopien eines einzelsträngigen RNA-Genoms, das nach dem Eindringen in eine sensitive Zelle in DNA umgeschrieben wird. Diese DNA wird als sog. Provirus hocheffizient in das Genom der Wirtszelle integriert. Ersetzt man Teile des retroviralen Genoms durch die zu transferierenden Sequenzen, so können die retroviralen Integrationsmechanismen für den Gentransfer genutzt werden. Beschränkungen dieses Verfahrens ergeben sich aus der limitierten Länge der transferierbaren DNA-Abschnitte (ca. 7000 Basenpaare) sowie der nicht völlig auszuschließenden Gefahr der Rekombination von Vektorsequenzen und endogenen retroviralen Sequenzen zu einem infektiösen Virus.

Das deutsche Tierschutzgesetz wird von den einzelnen Genehmigungsbehörden zum Teil sehr unterschiedlich ausgelegt, was sich auch in einer differierenden tierschutzrechtlichen Bewertung der einzelnen Schritte bei der Erstellung transgener Tiere niederschlägt. Die im Folgenden vorgeschlagene Einordnung wird als Grundlage einer nationalen Rechtsharmonisierung empfohlen.

3.1 Die Embryogewinnung
Zur Gewinnung von Embryonen werden Mäuseweibchen nach natürlicher Anpaarung getötet, die Eileiter und Uteri entnommen und in vitro gespült. Bei diesem Eingriff handelt es sich um eine Organentnahme nach Tötung der Spendertiere, die nach dem Tierschutzgesetz weder anzeige- noch genehmigungspflichtig ist. Um die Anzahl der Spendertiere zu reduzieren, ist es bei vielen Mäusestämmen sinnvoll, die Weibchen vor der Anpaarung hormonell zu stimulieren (sog. Superovulationsbehandlung). Hierzu sind zwei Injektionen mit einer wässrigen Hormonlösungen im Abstand von 48 Stunden notwendig. Diese Behandlung wird als routinemäßig eingesetzte biotechnische Zuchtmaßnahme angesehen und ist daher nicht als Tierversuch zu werten.

3.2 Der Gentransfer
Der Gentransfer erfolgt in Embryonalstadien bzw. ES-Zellen in vitro. Sollen diese genetisch veränderten Embryonen bzw. ES-Zellen ausschließlich für in vitro Untersuchungen genützt werden, so stellt dies gemäß §7 Abs. 1 TSchG. keinen Tierversuch dar. Sollen sie dagegen zu lebenden Individuen weiterentwickelt werden und erfolgt dies zu Versuchszwecken, ist der Gentransfer einschließlich der hierzu notwendigen Eingriffe und Behandlungen (Vasektomie von Böcken, Embryotransfer in synchronisierte Empfängertiere, Charakterisierung der transgenen Tiere) als genehmigungspflichtiger Tierversuch zu werten.

3.3 Zucht und Haltung
Die Zucht und Haltung transgener Linien einschließlich des hierzu notwendigen genetischen und hygienischen Monitorings ist nach § 11, Abschnitt 1, Nr. 1 TSchG in Verbindung mit dem Anhang V der GenTSV zu handhaben.

3.4 Versuche mit transgenen Tieren
Eingriffe und Behandlungen an transgenen Tieren zu Versuchszwecken, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sein können, sind analog zu Versuchen mit nicht-transgenen Tieren genehmigungs- bzw. anzeigepflichtig.

In Europa bestehen zwischen den Ländern enorme inhaltliche und formale Unterschiede bei der Genehmigung von Tierversuchen. Dies führt zu einer erheblichen Benachteiligung einzelner Forschungs- und Wirtschaftsstandorte mit der Konsequenz der Abwanderung der biomedizinischen Forschung. Daher ist es notwendig, für die Erstellung transgener Tiere neben einer nationalen auch zu einer internationalen Rechtsharmonisierung zu kommen. Es wird vorgeschlagen, das im Folgenden auszugsweise wiedergegebene Schweizer Genehmigungsverfahren allgemein einzuführen (z.B. bei der Novellierung des deutschen Tierschutzgesetzes). Ein in dieser Weise vereinfachtes Verfahren schränkt den praktischen Tierschutz in keiner Weise ein.

4.1 Genehmigungsverfahren in der Schweiz
Der wissenschaftliche Instituts- oder Laborleiter beantragt die Bewilligung für Tierversuche. Die genehmigende (kantonale) Behörde erteilt die Bewilligung, wenn die Anforderungen des Gesetzes erfüllt sind. Der Versuchsleiter muß über eine abgeschlossene Hochschulausbildung, in der Regel der Fachrichtungen Biologie, Veterinär- oder Humanmedizin, sowie über eine mindestens dreijährige Erfahrung auf dem Gebiet der Tierversuche verfügen. Er muß mit den Eigenschaften, Bedürfnissen und Krankheiten der Versuchstiere sowie mit ihrem Einsatz im Versuch vertraut sein.

Die Bewilligung gilt jeweils für Versuche oder Versuchsreihen mit in sich geschlossener Fragestellung oder mit fest umrissener Zielsetzung. Sie kann sich auf ein oder mehrere Tiere beziehen. Fragestellung oder Zielsetzung, Methodik und Tierarten werden in der Bewilligung festgehalten. Die Bewilligung kann Bedingungen und Auflagen hinsichtlich Fütterung, Pflege und Unterkunft der Tiere vor während und nach dem Versuch, sowie hinsichtlich der Zahl der Tiere enthalten. Art und Dauer allfälliger Abweichungen von den Haltungsvorschriften werden mit der Bewilligung festgelegt. Die Bewilligung wird befristet, in der Regel auf zwei Jahre.

Der Inhalt der Bewilligung gliedert sich in:

• Embryogewinnung bei Spendertieren (behandelt / unbehandelt)
• Injektionen
• Embryotransfer in pseudoträchtige Empfängertiere.
• Angaben über das Genkonstrukt oder über die ES-Zellinien werden nicht gemacht.

4.2 Melde- und Kontrollverfahren
Der Versuchsleiter ist verpflichtet, Abweichungen vom Normtyp, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind, der zuständigen Behörde zu melden und notwendige Maßnahmen zu ergreifen, die geeignet sind, Schmerzen, Leiden oder Schäden zu begrenzen. Die zuständige Behörde ist ihrerseits verpflichtet, jederzeit und ggf. unangemeldet Zucht, Haltung und Experiment zu kontrollieren.